CRISPR verursacht häufig schwere DNA-Schäden – wird aber oft übersehen

Die neueste einer langen Reihe von Artikeln ist jetzt veröffentlicht worden, in der die unbeabsichtigten Auswirkungen der CRISPR-Gen-Editierung detailliert beschrieben werden. Diese neue Übersichts-Arbeit [engl.: review] fasst die vielen Arten schwerwiegender unbeabsichtigter DNA-Schäden am Ziel-Ort (das heißt: an der vorgesehenen Bearbeitungsstelle) zusammen, die durch die Bearbeitung mittels CRISPR/Cas-Gen-Editing entstehen. 

Diese Überprüfung erscheint, als die Europäische Kommission und die britische Regierung weiter an ihrer Behauptung festhalten, dass die Gen-Editierung eine präzise, vorhersehbare und kontrollierbare Technik sei und dass daher mit dieser Technologie hergestellte Nahrungspflanzen genauso sicher seien wie solche, die durch konventionelle Züchtung erzeugt werden.

Die Autoren des neuen Artikels von der Rice University in den USA überprüften die Literatur zur Bearbeitung von Genen durch CRISPR-Editing in menschlichen, Primaten- und in Mauszellen. Sie fanden heraus, dass CRISPR-induzierte Doppelstrangbrüche in der DNA zahlreiche große unbeabsichtigte genetische Schäden am Ziel-Ort verursachten, darunter große und kleine Deletionen [Löschungen von Genen und Basenpaaren] und Insertionen [Einfügungen von DNA-Material] sowie chromosomale Umlagerungen des genetischen Materials. Und sie stellen fest, dass selbst große Genveränderungen am Ziel-ORT mit Standardmethoden nicht nachweisbar sind. 

Da es sich bei den in dem neuen Übersichts-Artikel hervorgehobenen unbeabsichtigten Auswirkungen durch die CRISPR-Genbearbeitung um sogenannte on-target-Mutationen, also Mutationen an der vorgesehenen Bearbeitungsstelle selber, handelt, wird eine Verbesserung der Ausrichtung des Bearbeitungstools diese Probleme nicht lösen, so wie GMWatch bereits zuvor davor gewarnt hat.

CRISPRs „potenziell irreversible Sicherheitsrisiken“

Wie erwartet stammen die Autoren der neuen Übersicht eher aus dem Bereich der klinischen Gentherapie als aus dem Bereich der landwirtschaftlichen Agro-Gentechnik. Als ein Beispiel für die weit verbreitete Besorgnis über die Ungenauigkeit von CRISPR im klinischen Bereich warnt ein kürzlich in Forbes veröffentlichter Artikel, dass die Gen-Editierung „potenziell irreversible Sicherheitsrisiken mit sich bringt“. 

Im krassen Gegensatz dazu tun Wissenschaftler der Gen-Editierung von Pflanzen und Nutztieren offenbar lieber so, als gäbe es keine unbeabsichtigten Auswirkungen der Genbearbeitung mit CRISPR. Diese Unterlassungslüge führt zu der grotesken und ironischen Situation, in der mit Interessenskonflikten behaftete Wissenschaftler und fehlgeleitete Politiker Verkaufsargumente über Präzision und Vorhersehbarkeit nachplappern, obwohl sich die wissenschaftlichen Beweise für das Gegenteil aufhäufen.

Unzureichendes Screening von unbeabsichtigten Auswirkungen

Die Autoren des neuen Papiers machen auf die unzureichenden Methoden aufmerksam, mit denen viele GVO-Entwickler nach unbeabsichtigten Auswirkungen der Gen-Editierung suchen. Während sie feststellen, dass große On-Target-Genveränderungen mit hoher Häufigkeit auftreten können, betonen sie, dass diese „durch standardmäßige Kurzstrecken-PCR-basierte Tests nicht nachweisbar sind, was zu einer Fehlinterpretation der Daten, einer verringerten Wirksamkeit und potenziellen Sicherheitsbedenken beim therapeutischen Gen-Editing führt“.  

GMWatch hat wiederholt auf die voreingenommenen und unzureichenden Screening-Methoden aufmerksam gemacht, die Gentechniker des landwirtschaftlichen Bereiches im Allgemeinen anwenden, was bedeutet, dass ihnen viele unbeabsichtigte Effekte entgehen. 

Mit diesem „Nicht suchen und nichts finden“-Ansatz ist es der Branche erfolgreich gelungen, die Europäische Kommission hinters Licht zu führen, die jetzt versucht, regulatorische Schutzmaßnahmen für die meisten gentechnisch editierten GVO aufzuheben. Eine ähnliche Schönfärberei hatten die GVO-Entwickler für die britische Regierung durchgeführt, die ein Gesetz mit der lächerlichen Bezeichnung „Genetic Technology (Precision Breeding) Bill“ verabschiedet hat, das fälschlicherweise davon ausgeht, dass gentechnisch editierte Pflanzen nicht riskanter sind als konventionell gezüchtete. 

Die Risiken und Probleme von für die Landwirtschaft gentechnisch editierten GVO wurden von Wissenschaftlern in vielen Artikeln, die von Experten [zuvor] geprüft worden waren, hervorgehoben, sodass es an dieser Stelle keine Entschuldigung dafür gibt, nichts davon zu wissen.

Die Lüge, gen-editierte Genome zu bereinigen

Wenn GVO-Befürworter die unbeabsichtigten Auswirkungen der Gen-Editierung zugeben, bestehen sie darauf, dass diese durch anschließende RückKreuzung leicht beseitigt werden können.   

Aber es ist nicht möglich, ein Genom von unbeabsichtigten Effekten zu befreien, wenn man nicht weiß, um welche es sich dabei handelt. Und es ist klar, dass die Entwickler von landwirtschaftlichen GVO nicht richtig nach solchen Auswirkungen suchen. Sie verwenden die falschen Werkzeuge zur Analyse. Das ist in etwa so, als würde man ohne jegliche Nachtsicht im Dunkeln nach einem verlorenen Schlüsselbund suchen. 

Darüber hinaus zeigt eine Analyse von Dr. Yves Bertheau, Forschungsdirektor am französischen Nationalen Institut für Agrarforschung, dass [die sogenannten] „Säuberungs“-Kreuzungen, wo sie durchgeführt werden, durch die Gewohnheiten und das Sachwissen der Entwickler sowie durch das verfügbare Material begrenzt sind. Daher werden solche „Genomreinigungen“ durch solche Rückkreuzungen in den meisten Fällen nicht gründlich genug durchgeführt. Infolgedessen ist es möglich, dass im endgültig vermarkteten GVO unbeabsichtigte genetische Schäden verbleiben, die potenziell gefährliche Folgen haben können. 

Wir kommen zu dem Schluss, dass GVO-Befürworter mit der Behauptung, sie würden ihre genetisch fehleranfälligen gentechnisch veränderten Pflanzen „säubern“, Politiker und die Öffentlichkeit grob in die Irre führen.

Prime-Editing und Basen-Editing werden die Technologie nicht retten
(SIEHE HILFE BEI ERKLÄR TEXTEN)  

Anpassungen der CRISPR-Gen-Editing-Methoden, bekannt als Basen-Editing (1) und Prime-Editing (2), werden oft als sicherere Alternativen zum Standard-CRISPR/Cas-Gen-Editing angepriesen, da letzteres Doppelstrangbrüche in der DNA verursacht, die oft zu ungenauen und unvorhersehbaren Wiederherstellungen durch den zelleigenen Reparatur-Mechanismus führen. Basen-Editing und Prime-Editing zielen darauf ab, Einzelstrangbrüche in der DNA anstelle von Doppelstrangbrüchen zu bewirken, und sind daher weniger anfällig für DNA-Reparaturen, die zu großen Deletionen [Löschungen oder Entfernungen], Insertionen und Neuanordnungen von genetischem Material führen.

Die Autoren des neuen Papiers sagen jedoch, dass auch das Basen-Editing und das Prime-Editing Probleme bereiten, da sie ebenfalls zu einem „geringen Grad“ Doppelstrangbrüche und unbeabsichtigte große DNA-Deletionen mit sich bringen können. Sie stellen fest, dass Wissenschaftler „ein besseres Verständnis“ der unbeabsichtigten Auswirkungen dieser Techniken benötigen, bevor sie für eine Gentherapie eingesetzt werden können.

Expertenkommentar zum neuen Papier

Der in London ansässige Molekulargenetiker Prof. Michael Antoniou kommentierte diesen neuen Übersichts-Artikel als „sehr aufschlussreich“, da er „zeigt, dass der ganze Hype vom Anbeginn [der CRISPR/Cas-Techniken] darüber, wie billig, einfach und leicht die CRISPR-Genbearbeitung sei, nicht mehr gilt. Es müssen dermaßen viele Modifikationen an der Grundmaschinerie vorgenommen werden, dass die Einfachheit nicht mehr möglich ist. Das Beste, was erreichbar ist, ist eine verringerte Häufigkeit von Mutationen abseits des Ziel-Ortes (Off-Target-) sowie unbeabsichtigten On-Target-Mutationen, die zu einer nicht intendierten Störung einer oder mehrerer Genfunktionen führen. Es wird schwierig oder unmöglich sein, sie zu eliminieren, da wir die beteiligten biologischen Prozesse nicht vollständig kontrollieren können.“

Prof. Antoniou erklärte dazu weiter: „Die Autoren geben an, dass Basen Editing und Prime Editing zu Doppelstrangbrüchen in der DNA führen können, wenn auch in geringer Häufigkeit. Aber bei der Gentherapie genügt ein [einziger] Doppelstrangbruch und die unbeabsichtigte Störung einer entscheidenden Genfunktion, etwa eines Tumor-Supressor-Gens, um eine Zelle auf den Krebspfad zu schicken.“ 

„Aus den sich häufenden Beweisen ist klargeworden, dass die Geneditierung im Hinblick auf unbeabsichtigte Folgen nicht besser zu sein scheint als die Genadditions-Gentherapie [bei der Gene hinzugefügt werden]. Bei der Genadditions-Gentherapie kann es zu einer Insertions-Mutagenese mit sehr geringer Häufigkeit kommen [das sind DNA-Schäden, die durch die Insertion des eingeführten therapeutischen Gens verursacht werden], was möglicherweise zu Krebs führt. In diesem Zusammenhang könnte die Editierung von Genen sogar riskanter sein als die Hinzufügung von Genen.

„Generell gibt es im klinischen Bereich strenge Sicherheitskontrollen. Wir hoffen jedoch, dass die Entwickler von Gentherapie mittels CRISPR-Gen-Editing Karzinogenitätsstudien in Zellkulturen sowie Langzeitstudien von mindestens einem Jahr Dauer an Tieren, beispielsweise Mäusen, durchführen. Nur solche Langzeitstudien könnten Krebserkrankungen aufzeigen, deren Entstehung beim Menschen mehrere Jahre dauern könnte. Kurz gesagt, die Genbearbeitung erfordert die gleichen strengen Tests wie die Genadditionstherapie, um das Nutzen-Risiko-Verhältnis zu bestimmen.“

Relevanz des Papiers für gentechnisch veränderte GVO in der Landwirtschaft

Prof. Antoniou erklärte, wie relevant das neue Papier für landwirtschaftliche gentechnisch veränderte CRISPR-Pflanzen ist: „Die Mutationen, auf die die Überprüfung hinweist – große Deletionen und Neuanordnungen an der vorgesehenen Zielstelle – können nur dann umfassend erkannt werden, wenn der Entwickler eine ultra-tiefgreifende, Langstrecken [engl.: Long-Read]-Sequenzierung vorzugsweise des gesamten Genoms vornimmt. Ohne diese Analyse werden ihnen viele dieser genetischen Fehler entgehen.

„Wir wissen, dass sie dies größtenteils nicht tun. Im Allgemeinen führen sie lediglich eine Kurzstrecken-PCR-Analyse an der vorgesehenen Editierungsstelle und an Stellen des Genoms durch, von denen Computerprogramme vorhersagen, dass sie durch die CRISPR-Aktivität abseits der Zielstelle beeinträchtigt werden könnten. Es ist jedoch bekannt, dass bei der Kurzstrecken-PCR-Analyse unbeabsichtigte umfangreiche Deletionen, Insertionen und Neuanordnungen der DNA übersehen werden. Zumindest müssen sie eine Langstrecken-PCR durchführen, um das Auftreten großer unbeabsichtigter genetischer Veränderungen zu erfassen.

„Dies ist insbesondere bei Pflanzen mit mehr als zwei Chromosomensätzen (polyploid) erforderlich. Brotweizen hat beispielsweise sechs Sätze (hexaploid). Wenn Sie diesen Weizen gentechnisch editieren, versuchen Sie, alle sechs Chromosomensätze zu bearbeiten. Möglicherweise haben Sie einen Gen-Ort [der 6 vorhandenen] Ihren Wünschen gemäß bearbeitet, aber was ist mit den fünf anderen? Die Regulierungsbehörden sollten den Nachweis verlangen, dass dies von den Pflanzengen-Editoren sorgfältig angegangen wird. 

„Solche Analysen sind von entscheidender Bedeutung, da unbeabsichtigte große genetische Umlagerungen infolge der CRISPR-Gen-Editierung die Funktion vieler Gene beeinträchtigen und möglicherweise zu einer giftigen oder allergenen Pflanze oder einer Pflanze führen könnten, die schädliche Auswirkungen auf die Umwelt hat.

„Bei mit CRISPR gentechnisch editierten Tieren könnten die in dieser neuen Überprüfung festgestellten genetischen Fehler Gesundheitsprobleme wie Krebs oder Geburtsfehler verursachen – wie es auch beim Menschen der Fall wäre.“

Was das Basen- und Prime-Editing in landwirtschaftlichen Pflanzen betrifft, dürfte die Bandbreite der Merkmale, die mit diesen Techniken erhalten werden können, im Vergleich zur Verwendung von CRISPR/Cas zur Erzeugung von Doppelstrangbrüchen sehr begrenzt sein. Und obwohl unbeabsichtigte On-Target- und Off-Target-Mutationen (an anderen Stellen im Genom als der Ziel-Editierungsstelle) reduziert werden können, werden sie auf Grundlage der in der neuen Überprüfung präsentierten Beweise [offenbar] nicht beseitigt. Und wieder scheint niemand [anderer] richtig hinzuschauen.

Auch wenn viele Politiker und Regulierungsbehörden mit Behauptungen über [vorgebliche] Präzision und Vorhersehbarkeit getäuscht wurden, bedeuten nach Ansicht von GMWatch die unvermeidbaren häufigen und genomweiten unbeabsichtigten genetischen Schäden, die durch den CRISPR-Gen-Editerungsprozess als Ganzes (das ist eine Kombination aus Pflanzengewebekultur, Pflanzen-Zelle-Transformation und den Wirkungen des CRISPR-Gen-Editing-Werkzeuges) verursacht werden, dass diese Technik nicht nur ihre Versprechen nicht einhält, sondern auch mit einem hohen Risiko einhergeht, der Gesundheit und der Umwelt dauerhafte Schäden zuzufügen.

Die neue Rezension:

Park, SH, Cao, M. und Bao, G. (2023). Erkennung und Quantifizierung unbeabsichtigter großer Veränderungen des Zielgens aufgrund der CRISPR/Cas9-Bearbeitung. Current Opinion in Biomedical Engineering, 100478. 
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S246845112300034X 

Highlights

* CRISPR/Cas9-Systeme erzeugen unbeabsichtigt große Genmodifikationen am Ziel-Ort. 
* Große Deletionen, Insertionen und chromosomale Umlagerungen können häufig vorkommen. 
* Große Genveränderungen sind mit standardmäßigen Kurzstrecken-PCR-basierten Tests nicht nachweisbar. 
* Es wurden neuartige Methoden zur Analyse von umfangreichen Auswirkungen am Ziel-Punkt der Gen-Editierung entwickelt. 
* Ein umfassendes Verständnis der Editierungs-Auswirkungen am Ziel-Ort ist für die Verbesserung der Sicherheit von entscheidender Bedeutung. 

Zusammenfassung der Review:

Die auf CRISPR/Cas9 basierende Genbearbeitung funktioniert typischerweise durch die Erzeugung eines DNA-Doppelstrangbruchs (DSB) am vorgesehenen Zielort in einer Zelle. Jüngste Berichte zeigten das Auftreten unbeabsichtigter großer Genmodifikationen am Ziel-Punkt durch CRISPR/Cas9-induzierten DSB, einschließlich großer Deletionen, Insertionen und chromosomaler Umlagerungen zusätzlich zu kleinen Insertionen und Deletionen. Diese zielgerichteten großen Genmodifikationen können hohe Häufigkeiten aufweisen, die durch standardmäßige Kurzstrecken-PCR-basierte Tests nicht nachweisbar sind, was zu einer Fehlinterpretation der Daten, einer verringerten Wirksamkeit und potenziellen Sicherheitsbedenken bei der therapeutischen Genbearbeitung führt. Hier fassen wir die jüngsten Fortschritte bei der Analyse großer On-Target-Geneditierungsergebnisse und ihre Auswirkungen auf die klinische Anwendung zusammen und diskutieren Möglichkeiten für zukünftige Verbesserungen.

Ende des Artikels

Fußnoten

(1)  Base Editing:  
„Modifizierte Form des CRISPR/Cas-Systems, mit der gezielt Punktmutationen hervorgerufen werden können, ohne dass ein Doppelstrangbruch entsteht. Dabei werden einzelne Basen ausgetauscht.

Wie beim CRISPR/Cas-System auch, wird beim Base Editing eine Guide RNA (gRNA) eingesetzt, die die zu verändernde Zielsequenz im Genom aufsucht. Die gRNA ist mit einem modifizierten Cas9-Enzym (dCas9 Nuklease) verbunden, das die DNA-Stränge zwar aufspaltet, aber nicht durchtrennt. Außerdem ist ein Enzym angehängt, welches eine Base am Zielort chemisch in eine andere Base umwandelt.

Zunächst war es nur möglich, mit einem Basen-Editor das Basenpaar Guanin-Cytosin (G-C) durch das Basenpaar Adenin-Thymin (A-T) zu ersetzen. Dann wurde ein neuer Basen-Editor entwickelt, der auch umgekehrt die A-T Paarung durch eine G-C Paarung austauscht.

Der Vorteil des Base Editings ist, dass im Gegensatz zur herkömmlichen CRISPR/Cas-Methode kaum Insertionen oder Deletionen an der DNA auftreten, da das zufällige Einfügen oder auch der Verlust von DNA-Bausteinen bei der Reparatur des Doppelstrangbruches entfällt.

Von Bedeutung ist Base Editing bisher vor allem in der Medizin. Da viele Krankheiten auf Punktmutationen im Genom zurückzuführen sind, erhofft man sich mit Base Editing eine erfolgreiche Bekämpfung dieser Krankheiten. Auch in der Pflanzen- und Tierzucht wird Base Editing zukünftig zunehmend von Bedeutung sein.

Base Editing kann auch bei RNA eingesetzt werden. Dabei wird die Boten-RNA (mRNA) als Bindeglied zwischen DNA und Proteinbildung verändert. Der Vorteil der RNA-Editierung ist, dass RNA natürlicherweise im Organismus abgebaut wird und es nicht zu einer dauerhaften Veränderung des Genoms kommt.“

Zitiert nach:  https://www.transgen.de/lexikon/2686.base-editing.html 

(2) Prime Editing:  
 „Beim Prime Editing handelt es sich um eine Weiterentwicklung der Genomeditierung mit Hilfe der Genschere Crispr/Cas9. Anstelle eines Doppelstrangbruchs wird jedoch nur einer der beiden DNA-Stränge geschnitten. Das Enzym Cas9 ist zudem mit einer reversen Transkriptase fusioniert, welche die neuen genetischen Informationen, vermittelt durch eine pegRNA, an dieser Stelle einfügt.“  
Zitiert nach: https://www.pflanzenforschung.de/de/pflanzenwissen/lexikon-a-z/prime-editing

Daten des Original-Artikels:

Titel:  CRISPR causes serious DNA damage with high frequency – but it’s often overlooked
Autor : Claire Robinson
Datum: 9 August 2023
URL: https://www.gmwatch.org/en/106-news/latest-news/20275 
-- Die Übersetzung ins Deutsche mit Anmerkungen in Eckklammern besorgte die GenAG von attac-bielefeld.

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